兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）試劑盒使用說明書

l 本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的含量。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

實驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的兔血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.  組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會影響后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑和器材

• 酶標(biāo)儀（450nm）
• 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
• 37℃恒溫箱
• 蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

備注：

1.  標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：480、240、120、60、30、15 pg/mL

2.  經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進行適當(dāng)稀釋后再進行實驗。

注意事項

• 嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
• 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
• 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
• 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
• 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
• 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
• 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
• 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
• 不能使用過期產(chǎn)品。
• 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準(zhǔn)備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.   設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.   樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.   除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.   棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.   每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.   每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結(jié)果計算

以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

•  檢測范圍：15 pg/mL – 480 pg/mL。
•  靈敏度：低檢測濃度小于1.0 pg/mL。
•  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
•  重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。