雞馬立克氏病PCR檢測試劑盒說明書（實時熒光PCR法）

【產(chǎn)品名稱】 

通用名稱：雞馬立克氏病PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）

英文名稱：Marek’s Disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T /盒 ＆ 50T /盒

【預(yù)期用途】

馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤和增大，引起肢(翅)麻痹，以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實時熒光PCR原理，主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評估有重要指導(dǎo)意義.

【檢驗原理】

本試劑盒針對MDV高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為雞基因組DNA，陽性對照為MDV經(jīng)滅活處理的核酸提取物。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：

(1) 咽喉拭子，采取時要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液；

(2) 泄殖腔拭子，將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便；

(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。

2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢。

4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

5.標(biāo)本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為10²CFU，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項】

1. 整個檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。

3. 為保證試劑不受標(biāo)本污染，必須將混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準(zhǔn)備區(qū)。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。

6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。

9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。